Это важно.

Мы предлагаем удобный сервис для тех, кто хочет купить – продать: земельный участок, дом, квартиру, коммерческую или элитную недвижимость в Крыму. http://crimearealestat.ucoz.ru/ Перепечатка материалов разрешена только при условии прямой гиперссылки http://allmedicine.ucoz.com/

Поиск

Реклама

Statistics


Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0

Нас смотрят

free counters

Ссылки.

Мы предлагаем удобный сервис для тех, кто хочет купить – продать: земельный участок, дом, квартиру, коммерческую или элитную недвижимость в Крыму. http://crimearealestat.ucoz.ru/

Чат

Главная » Статьи » Мои статьи

Митохондрия –точка приложения воздействия фармпрепаратов

 

Szewczyk A., Wojtczak L.

 

Mitochondria as a Pharmacological Target

 

Митохондрия –точка приложения воздействия фармпрепаратов

Lab Intracell Ion Channels, Lab Bioenergetics, Biomembranes Metabol Regul, Dept Cell Biochem, Nencki Inst Exp Biol, Polish Acad Sci, Warsaw, Poland

 

Pharmacol Rev 54:101–127, 2002

Перевод Кордеро Г. А.

Введение

Митохондрии играют центральную роль в процессах производства энергии в клетке. Митохондрии вовлечены в процессы апоптоза и кардиопротекции. Дисфункция митохондрий лежит в основе нейродегенеративных болезней Паркинсона, Хантингтона и Альцгеймера. Мутация митохондриальной ДНК нарушает функцию дыхательной цепи, снижает продукцию АТФ, повышает образование свободных радикалов и нарушает движение Ca2+. Эти события инициируют пероксидацию митохондриальной ДНК, протеинов, липидов и открывает митохондриальные поры, что вызывает апоптоз. Митохондрии являются мишенями для противодиабетических производных сульфонилмочевины, иммуносупрессантов, некоторых гиполипидемических препаратов и др. В обзоре рассмотрены механизмы действия фармакологических агентов на митохондрии.

Среди лекарственных препаратов, влияющих на функционирование митохондрий, выделяют препараты, целенаправленно воздействующие на митохондрии, и препараты, действие которых на митохондрии которых является побочным. Идентификация препаратов, воздействующих на митохондрии, позволит лучше изучить их влияние и создать новые препараты с заданными свойствами. Выявление побочных эффектов лекарственных препаратов на митохондрии позволит минимизировать эти эффекты.

Митохондрии также являются мишенями для множества токсинов.

II. Митохондрии и клетка

Количество митохондрий в клетке определяется ее потребностью в энергии. Соматические клетки содержат от нескольких десятков до нескольких тысяч митохондрий. Сперматозоиды человека содержат 16 митохондрий, а ооциты до 100 тыс. Метаболически активные органы (скелетная мускулатура, печень, мозг, сердце) содержат большое количество митохондрий, поэтому они чувствительны к препаратам, нарушающим их функцию данных органов.

В клетках млекопитающих 80—90 % АТФ синтезируется митохондриями. Дыхательная цепь содержит энзимы и низкомолекулярные коферменты, транспортирующие «восстановительные эквиваленты». Электроны и протоны направляются на молекулярный кислород в соответствии с их редокс-потенциалом. Ток электронов и протонов образует три каскада, в котором энергия восстановителя используется для переноса протонов из матрикса в межмембранное пространство. Образуемый протонный градиент (Δp) является источником энергии для АТФ-синтазного комплекса (рис. 1B). Этот градиент состоит из электрического компонента (Δψ) и градиента концентрации протонов. В результате трансмембранный потенциал достигает 180 мВ, а pH в матриксе равен 8 (284). Поэтому в матриксе могут накапливаться катионы

Между митохондриями и цитоплазмой существует постоянный обмен неорганических ионов и метаболитов.  На сегодняшний день доказано существование вольтаж-зависимых анионных каналов (VDAC) (245) в наружной  мембране митохондрий. Наружная мембрана митохондрий проницаема для полярных молекул менее 5 кДа. Внутренняя мембрана проницаема для воды, O2, CO2 и NH3. Другие гидрофильные молекулы переносятся через внутреннюю мембрану посредством специфических транспортеров. Важное значение  для транспорта гидрофильных молекул имеют переносчики фосфата (Pi), АДФ и АТФ, моно-, ди- и трикарбоновые кислоты. Большинство транспортеров являются обменниками, например, АДФ обменивается на АТФ, Pi на OH−, дикарбоновые анионы на Pi и т. д. (219, 292, 293, 363).

В митохондриях идентифицированы селективные каналы для K+, Na+, Mg2+ и Ca2+ (41). Для апоптоза значение имеют K+-каналы. Для поддержания мембранного потенциала и объема митохондрии — селективные обменники K+/H+, Ca2+/H+ и Ca2+/Na+ (41). Менее изучены ионные каналы внутренней мембраны митохондрий (36, 123).

Многие липофильные вещества свободно проникают через внутреннюю мембрану митохондрии, например, жирные кислоты. Недиссоциированные длинноцепочечные жирные кислоты пересекают мембрану механизмом «флип-флоп», что имеет значение для протонофорного действия жирных кислот (159, 261). Напротив, пересечение ионизированных жирных кислот происходит медленно (201). Однако, внутреннюю мембрану митохондрий анионы жирных кислот пересекают посредством неспецифических анионных транспортеров (434). Многие липофильные и амфифильные лекарственные препараты хорошо проникают в митохондрии.

Внутренняя и наружная мембраны митохондрий содержат разные наборы энзимов, а в местах контактов идентифицированы общие для обеих мембран структуры (54).

Митохондрии содержат циклическую ДНК, кодирующую около 20 белков комплексов дыхательной цепи. Однако большинство митохондриальных протеинов кодируются ядерной ДНК (236, 340).

Бо́льшая часть молекулярного кислорода идет на образование воды, а небольшая его часть — на образование реактивных видов кислорода (ROS): супероксида (O2•−), перекиси водорода (H2O2) и гидроксильного радикала (HO•). Образование ROS осуществляется в комплексе III и обусловлено циркуляцией протонов между убихиноном, цитохромами b и c1, а также железосерными протеинами (379). Некоторое количество ROS поставляет комплекс I. ROS нейтрализуются каталазой, пероксидазами и супроксиддисмутазой. Накопление ROS вызывают апоптоз.

Фармакологические агенты влияют на внутримитохондриальные процессы или транспортные пути, соединяющие митохондрии и цитозоль (рис. 1A).

III. Митохондрии и оксидативный стресс, старение, дегенеративные болезни

Митохондрии — главный источник супероксида и других ROS (74). Продуцентами митохондриальных ROS являются комплексы I и III (45, 64, 319) и моноаминооксидаза. Повреждающее действие ROS ограничивают митохондриальная MnSOD, цитозольная CuZnSOD и глутатионпероксидазы (26, 74, 134, 283, 411). Однако, при ишемии-реперфузии, действии некоторых ксенобиотиков, воспалении, старении, действии УФ и ионизирующей радиации, дефиците антиоксидантов, ROS могут реализовать свой повреждающий потенциал (64, 166, 167, 268, 319, 339). При старении, производство ROS митохондриями возрастает (64, 230, 232, 267, 319, 332). Митохондрии являются не только главным местом производства ROS, но и главной мишенью. Поэтому нарушение нейтрализации ROS в митохондриях запускает порочный круг, ведущий к апоптозу поврежденных клеток (232).

Одной из мер по защите митохондрий является повышение содержания в клетке глутатиона. Этого можно достичь при помощи предшественника глутатиона N-ацетилцистеина, который сам является антиоксидантом (38). Повышение содержания CoA можно достичь при помощи пантотеновой кислоты (366), которая повышает содержание глутатиона (364). Содержание глутатиона в клетке повышают куркумин, желтый пигментом специи карри (196) и анальгетик флупиртин (304). Эти вещества защищают митохондрии от ROS.

Внутриклеточными антиоксидантами также являются аскорбиновая кислота, α-токоферол, β-каротин (353) и α-липоевая кислота (290).

Убихинол, восстановленная форма коэнзима Q, является естественным антиоксидантом митохондриальной и клеточной мембран (16, 122, 131, 352). Редокс-пара убихинон/убихинол играет ключевую роль в дыхательной цепи митохондрий, обеспечивая связь между комплексами I, II и III (284). Возможно, что убихинон и убихинол являются потенциальными агентами, задерживающими старение (186, 230, 232). Коэнзим Q снижает проявления болезни Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона (34, 35, 69), возможно через нейтрализацию ROS в центральной нервной системе (268, 339).

Применение убихинола как антиоксиданта затруднено тем, что его активность определяется специфическим окружением в дыхательной цепи (45, 64, 285, 318). Возможно, что убихинол восстанавливает окисленные формы аскорбиновой кислоты и β-каротина.

Murphy с соавт. ковалентно соединили антиоксидант с липофильным катионом трифенилфосфона (82, 277, 367). Это привело к накоплению вещества в митохондриях в соотношении 104:1 (внутри и снаружи). Антиоксидантом выступали витамин E, убихинол и производные фуллерена (82). Тетрафенилфосфон, соединенный с витамином E, обладал мощным протективным эффектом против повреждения изолированных митохондрий системой, генерирующей гидроксильные радикалы (367).

Неопиатный анальгетик флупиртин (производное фтор-содержащего триаминопиридина) является эффективным антиоксидантом для митохондрий (343). Флупиртин предотвращал ROS-индуцированный апоптоз в культуре клеток (239) и защищал сетчатку кролика от ишемического повреждения (288).

Эффективным путем снижения продукции ROS митохондриями является разобщение окисления и фосфорилирования (360). Этого можно достичь посредством повышения проницаемости мембраны митохондрий для K+ и H+ через открытие митохондриальных K+-каналов или действия разобщающих протеинов.

Достоверно показано, что мевалонатный путь участвует не только в биосинтезе холестерина, но также в биосинтезе жизненно необходимого кофермента Q10 (CoQ10 или убихинона). Таким образом, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы блокируют синтез как холестерина, так и CoQ1 (П.Х. Лангсьон, A.M. Лангсьон США 2007) Восточно-Техасский Медицинский Центр, Тайлер, США

IV. Производные сульфонилмочевины и митохондрии

Антидиабетические производные сульфонилмочевины глибенкламид (глибурид) или глипизид связывают рецепторы сульфонилмочевины (SURs) плазматической мембраны различных клеток (23, 190). В β-клетках SURs закрывают KАТФ-каналы (22, 23, 225), повышая высвобождение инсулина (264). SURs β-клеток клонированы (6) и идентифицированы элементы, составляющие K-АТФ-каналы (188). Аналогичные каналы обнаружены в гладких миоцитах, скелетной мускулатуре, сердце и нейронах (108). Эти каналы содержат четыре внутрь ректифицирующих K+-канала (Kir) и четыре SURs.формируют K+-поры (5, 27, 350). Элементы SURs кодируются генами SUR1 или SUR2. SURs — представители суперсемейства АТФ-связывающих кассетных протеинов, содержат две нуклеотид-связывающих складки. SURs и формируют KАТФ-каналы с разными фармакологическими свойствами.

Антидиабетические (189, 299) и противоопухолевые (184) производные сульфонилмочевины  блокируют митоKАТФ-каналы.

A. Эффекты, оказываемые антидиабетическими производными сульфонилмочевины на митохондрии.

Эффекты антидиабетических производных сульфонилмочевины на транспорт K+ в митохондриях наблюдаются в интактных митохондриях (391) и в протеолипосомах с очищенными митоKАТФ-каналами (299). МитоKАТФ-каналы чувствительны к глибенкламиду только когда открыты Mg2+, АТФ, ГТФ или диазоксидом (193).

В интактных митохондриях печени крыс обнаружен один локус  связывания глибенкламида. (390). С меньшей аффинностью глибенкламид связывается с митохондриями сердца быка. (391). Связывание глибенкламида с митохондриями модулируется донорами SH-групп N-этил-малеимидом и мерсалилом (392).

Гидрофобная протонированная форма глибенкламида повышает проницаемость мембраны митохондрий для протонов (391). Глибенкламид и толбутамид ингибируют карнитинпальмитоилтрансферазу (79, 298) и пируваткарбоксилазу (431), что снижает скорость β-окисления жирных кислот.

B. Эффект противоопухолевых производных сульфонилмочевины на митохондрии

Диарилсульфонилмочевина — противоопухолевый агент против солидных опухолей и ксенотрансплантантов опухолей человека мышам (182, 184, 269). Диарилсульфонилмочевина неспецифично снижает активность делящихся клеток. В изолированных митохондриях N-(5-инданилсульфонил)-N'-(хлорфенил)мочевина и ее N-4-метил-аналог являются разобщителями окислительного фосфорилирования (401).

Производные диарилсульфонилмочевины N-(4-хлорфенил)-аминокарбонил-2,3-дигидро-1-инден-5-сульфониламид (сулофенур) и N-(4-хлорфенил)аминокарбонил-4-метилбензол сульфонамид (LY181984) являются эффективными противоопухолевыми агентами (375). Митохондрии накапливают сулофенур. Многие производные диарилсульфонилмочевины являются разобщителями окислительного фосфорилирования (329).

V. Митохондриальные дисфункции как следствие побочных  эффектов противоворусных препаратов

Митохондрии являются мишенями для противовирусных производных нуклеотидов (233, 378, см. обзор 32). Зидовудин (AZT) ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и замедляет прогрессирование СПИДа. AZT нарушает обмен веществ митохондрий сердца и вызывает кардиомиопатию.

В печени митохондриальная токсичность сопровождается повышенным отложением липидов, что приводит к мелко- или крупнокапельной жировой дистрофии печени. Иногда этому сопутствует повышение активности аминотрансфераз. В этом случае жировая дистрофия печени может прогрессировать с развитием печеночной недостаточности и лактацидоза — угрожающему жизни, но, к счастью, редкому осложнению.

Типичное осложнение митохондриальной токсичности — повышение сывороточного уровня лактата. Гиперлактатемия чаще описывалась при длительном лечении ставудином (Saint Marc, 1999; Carr, 2000), особенно в комбинации с диданозином. Токсичность диданозина также повышается в результате взаимодействий с рибавирином и гидроксимочевиной. Значение бессимптомной гиперлактатемии не ясно. Если повышение уровней лактата проявляется клинически, симптомы часто бывают неспецифичными — тошнота, болезненность в правом подреберье, миалгия. В большинстве случаев уровни бикарбоната и анионный интервал (Na+ [HCO3 + Cl]) в норме, но активность печеночных аминотрансфераз в большинстве случаев слегка повышена (Lonergan, 2000a). Поэтому в диагностике приходится полагаться на более трудоемкое определение сывороточного уровня лактата. Чтобы избежать ошибок, венозную кровь следует брать в покое, без наложения жгута. Кровь следует собирать во фторированные пробирки, помещать в холод ( обкладывать льдом)и сразу доставлять в лабораторию для незамедлительного исследования. В дифференциальной диагностике следует учитывать, что причиной лактацидоза могут быть не только повреждение митохондрий (табл. 1); следует исключать повреждение различных органов.

AZT ингибирует активность энзимов дыхательной цепи и нарушает их синтез.

У молодых крыс AZT быстро вызывает кардиомиопатию (385). AZT повышает продукцию ROS и пероксинитрита в сердце и вызывает разрывы цепи ДНК, накопление липопероксидов и карбонилов белков, также AZT снижает отношение АТФ/АДФ в митохондриях сердца крыс со 340 до 90. У пациентов со СПИДом главной причиной кардиомиопатии при лечении AZT могут быть ROS (385). AZT конкурентно ингибирует АТФ/АДФ-антипорт в изолированных митохондриях сердца крыс (413). Однако, AZT не влиял на активность дикарбоксилатного, оксодикарбоксилатного и трикарбоксилатного транспортеров (413).

Мембранный потенциал митохондрий у крыс, получавших AZT, был аналогичен потенциалу в интактных митохондриях, инкубируемых в среде содержащей AZT (132, 251). AZT конкурентно ингибирует нуклеотиддифосфаткиназу, действие которой предотвращается высокими концентрациями ГТФ (414).

AZT вызывает оксидативное повреждение митоДНК в мышцах (100) и печени (101). МитоДНК печени у мышей, получавших AZT содержала более 40% 8-оксо-7,8-дигидрокси-2'-дезоксигуанозина, чем контрольная митоДНК (101). У крыс, получавших AZT повышен уровень делеций митоДНК в митохондриях мышц (251). AZT снижал активность цитохромоксидазы и нарушал синтез тяжелых цепей миозина (MHC) α и β, что нарушало сократимость сердца с развитием миопатии (257).

В клетках гепатомы человека, AZT повышал уровни лактата, снижал активность цитохромоксидазы и цитратсинтазы (294).

Противоретровирусный препарат 2',3'-дидезоксицитидин (ddC, зальцитабин) у молодых крыс быстро нарушал функцию сердца, повышал продукцию ROS в скелетных миоцитах, снижал содержание в сердце белка теплового шока (HSP) 70, но не HSP25 или HSP60 (325, 361).

VI. Нестероидные противовоспалительные препараты и митохондрии

Нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs) аспирин и ибупрофен подавляют воспаление и боль (376). Нестероидные противовоспалительные препараты  ингибируют циклооксигеназу, что снижает продукцию простагландинов (200) и снижают риск  развития рака толстой кишки (20, 33, 377). Принимая во внимание, что Нестероидные противовоспалительные препараты могут вызвать язву желудка, перфорацию и кровотечение, предложен возможный механизм повреждения митохондрий в очаге воспаления (91, 371, 372) через остановку клеточного цикла и индукцию апоптоза (310).

Нестероидные противовоспалительные препараты разобщают окисление и фосфорилирование, снижают продукцию АТФ, ингибируют адениннуклеотидтранслоказу и вызывают диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий (28, 243, 252, 265, 266, 271, 308, 405). Эти эффекты оказывают диклофенак, дифлунисал, мефенамовая кислота, толфенамовая кислота, флуфенамовая кислота и пироксикам в микромолярных концентрациях, а также салициловая кислота, ацетилсалициловая кислота и дипирон в милимолярных концентрациях (252, 266, 308).

Разобщающий эффект салициловой кислоты и аспирина частично обусловлен индукцией PTP ( Пора перемещения проницаемости) в присутствии Ca2+ (439, 405), а этот эффект ингибируется Mg2+ и циклоспорином А (11, 47, 56).

Другие нестероидные противовоспалительные препараты открывают  поры перемещения проницаемости ,которые также блокируются циклоспорином А, АТФ, АДФ и рутением красным (12, 160, 161, 265, 266, 309, 412, 439).

Множественные эффекты нестероидных противоспалительных препаратов показаны на рис. 6 Нестероидные противовоспалительные препараты  ингибируют β-окисление жирных кислот (58, 70, 107, 136, 150, 221, 247, 248, 305, 408, 409, 428).

 

Циклоспорин А, известный в качестве блокатора кальциевого канала в митохондриях, предупреждающий апоптоз, также приводит к избирательному снижению

активности сукцинатдегидрогеназы и подавляет синтез АТФ в эпителии извитых канальцев почки и восходящих канальцах петли Генле, причем реакции сильнее в

субкапсулярной зоне органа и в наружном слое мозгового вещества; это требует оценки

целесообразности применения медикамента при нефропатиях [41]. Дыхательная и энергетическая функция митохондрий снижена при использовании ряда цефалоспоринов; некоторые из них имеют структурное сходство с карнитином и замедляют его транспорт

в почечных митохондриях[44].

Дыхательная и энергетическая функция митохондрий снижена при использовании ряда цефалоспоринов; некоторые из них имеют структурное сходство с карнитином и замедляют его транспорт в митохондриях клеток.

Гентамицин обладает нефротоксическим действием, способствуя выработке клеткой и

ее митохондриями активных форм кислорода, что наиболее проявляется в корковом

веществе, где много митохондрий; это опасно риском развития почечной недостаточности [45].

Глюкокортикоиды, назначаемые больным гломерулонефритом в сверхвысоких дозах, угнетают энергетический обмен в лимфоцитах крови с депрессией сукцинатдегидрогеназы и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы; при средних дозировках дозировке терапевтический эффект стероидной терапии может быть положительным. Иммуносупрессивные препараты при лечении детей с гломерулонефритом, уменьшая активность ферментов митохондрий, угнетают и продукцию гамма-интерферона, что снижает у детей противоинфекционную защиту.

VIII. Местные анестетики и энергетический метаболизм в митохондриях

Местные анестетики блокируют потенциал действия чувствительных нейронов (357, 400). Большинство местных анестетиков являются третичными аминами, поэтому проявляют липофильные свойства и являются разобщителями окислительного фосфорилирования (87, 143, 156, 179, 383). Местные анестетики блокируют митохондриальную АТФазу (3, 4, 88, 89, 417) и энзимы дыхательной цепи (77, 416).

Местные анестетики ингибируют транспорт ионов в митохондриях (73, 262, 351, 77), адениннуклеотидтранслоказу (374), метаболическую активность (152, 172) и фосфолипазы (342, 423). Примечательно, что в низких концентрациях дибукаин активирует, а бутакаин ингибирует фосфолипазу A2 (423), однако в высоких концентрациях дибукаин ингибирует, а бутакаин активирует фосфолипазу A2.

Сообщалось, что нуперкаин (дибукаин) защищает систему сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях (10, 337), что, очевидно, обусловлено ингибированием фосфолипазы A2. Позже было показано, что местные анестетики являются разобщителями (396), поскольку являются липофильными протонофорами (126, 347, 394, 430).

Ропивакаин (125, 110, 313) и бупивакаин (125, 313) ингибирует транспорт электронов в комплексах I и II, что снижает синтез АТФ и вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны.

Дибукаин ингибирует набухание митохондрий и окисление тиоловых групп мембранных белков, ассоциированное с активацией PTP ( Поры перемещения проницаемости) (213). Дибукаин также ингибирует Ca2+-индуцированную генерацию ROS в митохондриях (213), что, по-видимому, обусловлено ингибированием PTP (213). Дибукаин ингибирует рост и дифференцировку промиелоцитов в гранулоциты при лейкозе (21). В высоких концентрациях дибукаин индуцирует фрагментацию ДНК характерную для апоптоза, что полностью блокируется неспецифическим ингибитором каспаз z-Val-Ala-Asp-(OMe)-фторметилкетоном. Дибукаин активирует каспазу-3, -6, -8 и -9, но не каспазу-1, индуцирует деполяризацию мембраны митохондрий, стимулирует выход цитохорома С в цитозоль (21).

 

Заключение

Таким образом, приобретенные нарушения митохондриальных функций возникают как следствие повреждения структур митохондрий, под влиянием свободнорадикальных процессов, нарушения работы дыхательных комплексов, активизации механизмов деградации митохондрий, стимуляции апоптогенных сигналов, увеличения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток органов мишеней патологического процесса. Инициируются интегративные механизмы негативного воздействия митохондриальной дисфункции на процессы в клетках и тканях организма: нарушение синтеза АТФ и других метаболических процессов в митохондриях; продукция активных форм кислорода; активация программированной гибели клетки. В зависимости от типа патологического

процесса, нарушения функций митохондрий могут служить в качестве одного из основных механизмов данного заболевания или создавать благоприятные условия для его развития. По всей видимости, специфичность проявлений митохондриальной дисфункции определяется индивидуальными особенностями клеток и тканей, в которых они  локализованы, а также воздействием ряда других патогенетических факторов.

Длительный прием фармакологических препаратов способствует  также развитию митохондриальных дисфункций.

Так,повреждение митохондрий развивается   при постоянном приеме кордарона, пероксилина, НПВС, антидепрессантов и др. препаратов [46]. Их катионные амфифильные молекулы накапливаются в митохондриях и тормозят их функции b-окисления и дыхания [47]. Торможение дыхательной функции индуцирует накопление АФК в митохондриях и образование продуктов переокисления липидов в жировых депо. Аналогично, злоупотребление алкоголем повышает образование АФК, продуктов переокисления липидов и способствует развитию стеатогепатита [46]. Как АФК, так и продукты переокисления липидов индуцируют высвобождение цитокинов (TGF-b, TNF-a, IL-8), которые участвуют в прогрессировании НАСГ

Категория: Мои статьи | Добавил: galinadoctor (13.09.2010)
Просмотров: 1120 | Теги: митохондрии, оксидативный стресс, старение, дегенеративные болезни | Рейтинг: 0.0/0 |
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Раскрутка сайта - регистрация в каталогах PageRank Checking Icon Яндекс цитирования